Mikroskop (ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu)

IŞIK MİKROSKOP

  Geleneksel ışık, faz kontrast, değişimli (diferansiyel) girişim, polarizasyon, konfokal ve floresan mikros- kopkum tümü, ışık ile doku bileşenlerinin etkileş­mesi remeline dayanır. Işık mikroskopta, boyalı pre- paratlar genelde arkadan aydınlatma ile İncelenmektedir. Mikroskop hem mekanik hem de optik bölümlerden oluşur (Şekil 1-2). Optik parçalar, üç mercek sisteminden oluşur: Kondansatör, objektif ve oküler. Kondansatör incelenen nesneyi aydınlatan bir ışık demeti oluşturacak şekilde ışık kaynağından gelen ışığı toplayıp odaklar.

   Objektif incelenen nesnenin aydınlatılan görüntüsünü okülere doğru büyütür ve izdüşümünü oluşturur.Oküler, bu görüntüyü daha da büyü­tür ve gözlemcinin
retinası ya da bir fotoğraf plakası üzerine düşürür. Toplam büyütme ise, objektif ve oküler mercekleri­nin büyütme güçlerinin çarpımı ile elde edilir.

Çözümleme Gücü

Mikroskopta ayrıntılı net bir görüntü elde edilmesini sağla­yan en önemli etken, iki parçacığın ayrı nesneler olarak gö­rülebildiği en küçük mesafe anlamına gelen çözümleme gücüdür (rezolüsyon). Işık mikroskoplarının en yüksek çö­zümleme gücü yaklaşık 0.2 pm.dir; bu özellik 1000-1500 kez büyütmede iyi görüntü sağlar. 0,2 pm.den daha küçük nes­neler (zar ya da aktin filamanı gibi) bu aletle seçilemezler. Aynı şekilde, aralarında 0.2 pm.den daha yakın mesafe olan iki mitokondri ya da iki lizozom gibi nesneler de tek bir nes­ne olarak seçilir. Görüntünün niteliği ve ayrıntılarının zen­ginliği mikroskopun çözümleme gücüne bağlıdır. Büyütme ise, yüksek çözümleme gücüyle beraber olduğunda değer taşır. Bir mikroskopun çözümleme gücü, objektifinin kalite­sine bağlıdır. Oküler merceği, objektifin sağladığı görüntüyü büyütür, çözümleme gücünü etkilemez. Bu nedenle farklı büyütme gücündeki objektifler karşılaştırılırken, yüksek bü­yütme yapabilen objektiflerin, aynı zamanda yüksek çözüm­leme gücüne de sahip olduğunu göz önünde tutmak yerin­de olur.Yüksek duyarlıklı video kameralar ışık mikroskobun gü­cünü artırır ve bilgisayara aktarılarak, görüntü analizi yap­maya ve baskı çıkışı almaya elveren sayısal görüntülerin el­de edilmesini olanaklı kılar.

Işık mikroskobun sınırları ışığa karşı yüksek düzeyde duyarlı video kameraların kullanılmasıyla yeniden tanımlan­mıştır. Okülerden doğrudan bakıldığında görülemeyecek ka­dar küçük olan nesneler, kameralar ve görüntü iyileştirici programlar kullanılarak video ekranında görünür hale geti­rilebilir. Bu video sistemleri canlı hücrelerin uzun süreyle gözlenmesinde yararlı olabilir çünkü, düşük ışık düzeyinde görüntü alabilirler, bu şekilde yoğun ışığın oluşturacağı hüc­re hasarı önlenmiş olur.

Video kameralarla alman elektronik görüntüler kolaylık­la sayısal görüntüye dönüştürülebilir ve bilgisayar program­ları aracılığıyla deneyin gerektirdiği uyarlamalar gerçekleşti­rilebilir. Sözgelimi, örnek doğrudan ışık mikroskop altında incelenirken o anda seçilemeyen yapı bilgisayar üzerinden kontrast artırma tekniği ile görünebilir hale getirilebilir. Gö­rüntü analizi için geliştirilen yazılımlar mikroskobik yapıla­rın ölçülmesine olanak sağlar.

FAZ KONTRAST MİKROSKOP

           C Şekil 1-3. Kültürde çoğaltılmış olan nöral kabartı (krista) hücreleri­nin farklı optik tekniklerle görünüşü. Hücreler boyanmamıştır ve her üç fotoğrafta da aynı hücreler görülmektedir. Her fotoğrafta görün­tüye uyum açısından pigmentli iki hücreye dikkat edin. A: gelenek­sel ışık mikroskobu. B: faz kontrast mikroskobu. C: Nomarski dife- rensiyalgirişim mikroskobu. Büyük büyütme (S. Rogers’ın izniyle}.

            

Bazı optik düzenlemeler boyanmamış hücrelerinve doku kesitlerinin incelenmesine olanak sağlar.Boyanmamış biyolojik örnekler genellikle saydam­dır ve biyolojik örneğin tüm bölümleri hemen aynı optik yoğunluğa sahip olduğundan ayrıntılı olarak görüntü­lenmesi güçtür. Ancak faz kontrast mikroskobu, geçirgen nesneden seçilebilir görüntüler elde edebilen bir mercek sis­temine sahiptir (Şekil 1-3).

Kutuplaştırma mikroskobu yüksek düzeyde düzen­lenmiş moleküllerden oluşan yapıların tanınmasını sağlar. Kutuplaştıran bir filtreden geçen normal ışık sadece bir yönde titreşerek filtreden çıkar. Mikroskop­taki bu filtrenin üzerine ikinci bir filtre, ana ekseni ilk filtreye dik olacak hiçimde yerleştirildiği zaman ışık geçmez ve hu du­rumda karanlık alan etkisi oluşur. Bununla birlikte polarize edi­ci iki filtre arasına, belli bir yöne doğm yönlenmiş moleküller (örneğin selüloz, kolajen, mikrotübüller, mikrofilamanlar) içe­ren doku yapıları yerleştirilmiş ise, belli bir düzende yinelenen moleküler yapılar, polarizörden çıkan ışığın eksenini saptırırlar. Sonuç olarak koyu zemin üzerinde yapılar parlak görünür (Şe­kil 1-4). Kutuplaştırılmış ışığın titreşim yönünü saptırma yetene­ğine çift kırma denir ve bu özellik, kristalli maddeler ya da yönlenmiş moleküller içeren maddelerde mevcuttur.

              KONFOKAL MİKROSKOP

Konfakal mikroskop bir hücre ya da kesitin çok in- ce bir düzlemine tam olarak odaklanabilmeyi ola- nakli kılar. İşık mikroskoptaki odak derinliği, özel­likle kiiçük büyütme objektiflerinde, oldukça uzun­dur. Bu durum, örnek üzerinde oldukça derin bir bölgenin net görünmesi, sonuçta 3 boyutlu bir nesnedeki görüntüle­rin üst üste gelmesi sonucunu doğurur. Konfokal mikrosko- pun en önemli özelliklerinden birisi, odaklanan bölgede çok ince bir düzlemin net görünmesidir. Bu sonucu yaratan tek­niğin dayandığı ilkeler şu şekilde sıralanır: (1) örnek çok in­ce bir ışık demetiyle aydınlatılır (oysa ışık mikroskopta ör­nek üzerine geniş bir ışık demeti düşmektedir); (2) örnekten gelen görüntü küçük bir delikten geçer. Bunun sonucunda yalnız odaklanan düzlemdeki görüntü algılayıcıya ulaşması­na karşın, bu düzlemin önünde ve arkasında kalan görüntü­ler engellenir (Şekil 1-5). Odak dışında kalan nesnelerin ka­rışan görüntüleri ortadan kalkar ve bu şekilde, odaktaki nes­nenin görüntüsü ışık mikroskoptakinden daha net ve yeri daha kesin görülebilir.

Uygulamaya dönük nedenler yüzünden, çoğu konfokal mikroskopla aşağıda belirtilen düzenleme kullanılmaktadır (Şekil 1-6): (1) ışık kaynağı olarak lazer kullanılır; (2) ışık kaynağı çok küçük bir nokta halinde olduğundan, daha ge­niş alanları gözlemlemek için örnek üzerinde hareket eiıirilmelidir (tarama); (3) incelenecek olan örneğin floıesan bir molekülle İşaretlenmesi gerekir (bu, rutin kesitlerle çalışıla- maz anlamına gelmektedir); (4) örnekten yansıyan ışık, gö­rüntünün oluşturulmasında kullanılır; (5) yansıyan ışık, bu­lucu tarafından yakalanır ve işaret, elektronik olarak alıcıda görülebilecek hale getirilir.

Her seferinde çok ince bir düzlem odaklanabildiğinden, birkaç net düzlemi birleştirmek ve bu şekilde 3 boyutlu gö­rüntüye dönüştürmek olasıdır. Bu özellikler, konfokal mik­roskobu bilgisayara bağımlı bir teknik haline getirmektedir.

         FLORESAN MİKROSKOP

Belli floresan maddeler uygun dalga boyundaki ışık altına tutulduğunda daha uzun dalga boyunda ışık yayarlar. Bu olaya floresans denir. Floresan mikroskopta doku kesitleri, genelde yayılan ışık yelpazesinin görülebilir kısmında yer alacak şekilde morötesi ışık altına tutulur. Floresan madde­ler karanlık bir zemin üzerinde parlak, ışıltılı parçacıklar şek­linde izlenir. Güçlü bir morötesi ışık kaynağının kullanıldığı bir mikroskopla araştırıcının gözlerini korumak için objektif merceklerinden sonra morötesi ışığı süzecek olan özel filtre­ler bulunmaktadır.

Hücrelerin iri moleküllerine karşı çekiciliği olan floresan bileşikler, floresan boyalar olarak kullanılmaktadır. En yaygın kullanılan boya DNA ve RNA ile bileşik oluşturabilen ak­ridin turuncusudur. Floresan mikroskopta incelendiğinde DNA-akridin turuncusu kompleksi sarımsı-yeşil ışık yayar­ken, RNA-akridin turuncusu kompleksi kırmızı-turuncu ışık yayar. Bu şekilde hücrelerin içindeki nükleik asitleri belirle­mek ve yerlerini saptamak mümkündür (Şekil 1-7). Floresan mikroskobun başka bir kullanım alanı da floresan maddele­rin (floresein izotiyosiyanat gibi) doku bileşenlerine özel olarak bağlanacak olan belirteç moleküllerle birleştirilmesi ve bu sayede söz konusu bileşenlerin mikroskopta saptan­masıdır (bkz. Moleküller Arasındaki Yüksek Çekimli Etkile­şimlere Dayalı Saptama Yöntemleri).

ELEKTRON MİKROSKOP

Hem transmisyon hem de tarama (scanning) elekt­ron mikroskopları, elektronlarla doku bileşenleri­nin etkileşmesi temeline dayanır.

Transmisyon Elektron Mikroskobu

Elektron mikroskobu, yüksek çözümleme gücü ile inceleme­ye olanak veren (0.1 nııı) bir görüntüleme sistemidir. Bunun­la birlikte, uygulamada kaliteli cihazların çoğunda çözümle­me gücü 3 nm. civarındadır. Bu çözümleme gücü, görüntü ayrıntılarının 400.000 kez büyütülerek görülebilmesini sağlar.

Ne yazık ki, bu büyütme yalnız yaiıtık molekülleri ya da par- tikülleri görüntülemede kullanılr. Çok ince doku kesitlerinin ayrıntıları yaklaşık 120.00ü büyütmede görülebilmektedir.

Transmisyon elektron mikroskobunun çalışması, ışığın cam merceklerdeki sapma davranışının benzeri olan, elekt­ron demetinin elektromanyetik alanlarda sapma ilkesine da­yanır. Elektronlar, vakıım ortamında metal (genelde tungs­ten) bir (¡lamanın (katot) yüksek derecede ısıtılmasıyla elde edilir. Elektronlar salıverildikten sonra, katot ile anot arasın­da yaklaşık 00-100 kV ya da daha fazla gerilime sokulur. Anot, merkezinde ufak bir delik olan metal bîr plakadır. Elektronlar katottan anoda doğru ivme kazanarak hızlanır, anodun merkezindeki açıklıktan geçer ve tüpün içine gire­rek kesintisiz bir elektron akımı (demeti) oluştururlar. Bu demet, kabaca optik mikroskopta olduğu gibi, elektrik bo­binleri tarafından saptırılır, çünkü elektromanyetik alana gi­ren elektronlar yön değiştirir. Bu nedenle elektron mikros­kopların elektrik bobinlerine elektromanyetik mercek denir.

Elektron mikroskobun parçaları, optik bölümler genel­likle üstte yer almasına karşın, optik mikroskopla çok ben­zeşmektedir (Şekil 1-9). Birinci mercek, elektron demetini kesit üzerine odaklayan bir kondansatörden oluşmaktadır. Bazı elektronlar kesitteki atomlarla etkileşime girerek yolu­na devam ederken, diğerleri etkileşmeksizin, örneğin için­den geçer. Elektronların büyük bir bölümü büyütülmüş gö­rüntüyü oluşturan ve daha sonra bu görüntüyü başka bir bü- yütiıcü merceğe gönderen objektife ulaşır. İnsan gözü elekt­ronlara karşı duyarlı olmadığından, görüntü son aşamada floresan bir ekrana ya da fotoğraf plakalarına veya elektro­nik kameraya düşürülür.

Transmisyon elektron mikrosko­bunda elde edilen görüntülerin büyük bölümü floresan ekrana çarpan elektronlarla, mikroskobun tüpü içinde kalan elektronlar arasındaki dengeye bağlı olarak oluştuğundan, ortaya çıkan görüntü daima siyah beyazdır. Elektron mikros­kop fotoğrafının koyu alanları elektron yoğun,açık renkli alanlar ise elektron geçirgen olarak adlandırılır.

Elektron mikroskopta örnek ile elektronlar arasında uy­gun bir etkileşim oluşturmak için kesitlerin çok ince (40- 90nm) olması gerekir; bu yüzden örnek epoksi plastik içine gömülür. Bu şekilde hazırlanan bloklar ancak cam ya da el­mas bıçaklarla kesilebilecek kadar sert olur. Cok ince alınan kesitler küçük metal ağlar üzerinde toplanır ve analiz için mikroskobun içine konur.

Elektron mikroskopta kullanılan dondurma teknikleri yöntemi dokuları tespit etmeye ve gömmeye gerek olmaksı­zın incelemeyi olası kılar. Bu teknik güç olmasına karşın, or­taya çıkan hatalar başka yöntemlerdekinden daha azdır. Dondurulmuş dokular kesilebilir ve bunların üzerinde histo- kimya, ya da imünohistokiıııya çalışılabilir veya dokular, zar­larının İç yapısı incelenmek üzere dondurulduktan sonra kı­rılabilir (dondurma-kırma).

Tarama Elektron Mikroskobu

Tarama elektron mikroskobu hücrelerin, dokuların ve or­ganların yüzeyine ait yakıncı 3 boyutlu görüntüler oluşturur.Bu mikroskop, örnek üzerinde bir noktadan başka bir nok­taya sırayla hareket ettirilen (tarama) çok ince bir elektron demeti oluşturur. Transmisyon elektron mikroskobundan farklı olarak, elektronlar örneğin içinden geçmez (Şekil 1- 10). Elektronlar, daha önceden doku üzerine kaplanan çok ince bir metal tabaka üzerine çarpar ve yansır ya da saçılır. Bu elektronlar bir algılayıcı tarafından yakalanarak yükselti­cilere ya da başka cihazlara aktarılır ve oluşturulan sinyalin son biçimi bir televizyon monitörüne aktarılır. Oluşan gö­rüntüler siyah beyazdır. Sonuçta çekilen fotoğraflar kolayca anlaşılır. Çünkü, tıpkı olağan yaşamımızda olduğu gibi yu­karıdan aydınlatma sonucu oluşan aydınlık ve gölgeli alan­larla dolu bir görüntü elde edilir. Tarama elektron mikrosko­bu yalnız yüzeyleri gösterir. Organların içi, dondurulmaları ve iç yüzeylerini ortaya çıkarmak üzere kırılmalarıyla incele­nebilir.

DOKU KESİTLERİNDE OTORADYOGRAFİ

Otoradyografi, doku kesitlerindeki biyolojik olayla- rın radyoaktivite ile araştırılmasıdır. Otoradyografi- de, yayılan radyasyonun fotoğraf emülsiyonları üzerindeki etkileri ile dokulardaki radyoaktif mad- - delerin yeri belirlenir. Emülsiyondaki gümüş bromür kristal­leri tıpkı normal fotoğrafta ışığa karşı olduğu gibi, radyoak­tiviteyi saptayan mikro algılayıcılar işlevini görür. Çalışmanın amacına göre çok laikli moleküller (radyoaktif aminoasitler, radyoaktif nükleotidler ve radyoaktif şekerler) kullanılabilir. Bu moleküller, protein, niikleik asit ya da polisakkaıit ve gli- koprotein gibi daha büyük moleküllerin sentezinde kullanıl­dıklarından işaret olarak adlandırılırlar. Doku kesitleri hazır­lanır ve fotoğraf emülsiyonu ile kaplanır. Lamlar, ışık geçir­meyen kutularda bekletilir ve yeterince pozlama yapıldıktan sonra, fotoğraf banyosunda geliştirilerek incelenir. Radyas­yon alan gümüş bromiir kristalleri küçük, siyah gümüş me­tal tanecikleri haline indirgenir. Radyoaktif moleküller içe­ren yapılar bu tanecikler tarafından örtülür. Bu işlem hem ışık, hem de elektron mikroskopta uygulanabilir (Sekil l- 11).

Şekil 1-11. Öldürülmeden 8 saat önce ³H fukoz en­jeksiyonu yapılmış fare submandibüler bezinden hazırlanan otoradyograf- lar. Üstte: Radyoaktif böl­geleri belirten siyah gü­müş granüllerini gösteren mikrograf. En çok radyo­aktivite salgı kanalı hücre­lerinin granüllerinde görül­mektedir. Büyük büyütme. Altta: Elektron mikrosko­bik otoradyografi için ha­zırlanan aynı dokudaki hücreler. Büyük büyütme­de, çoğunlukla granüller (G) üzerinde ve bez tüme­ninde (L) yer alan sarmal yapılar şeklindeki gümüş tanecikleri (T.G. Lima ve H.Haddad’ın izniyle).

Doku bileşenlerinde radyoaktivitenin yerini göstermek­le daha fazla bilgi elde edilebilir. Yani, radyoaktif bir amino- asit kullanılıyorsa, dokudaki hangi hücrelerin proteini daha fazla, hangilerinin daha az sentezlediğini belirlemek olasıdır, çünkü, hücrelerin üzerinde yoğunlaşan gümüş granüllerinin sayısı ile protein sentezinin yoğunluğu doğru orantılıdır. Radyoaktif bir DNA işareti (ör., radyoaktif timidin) kullanıl­dığında, hangi hücrelerin (ve kaç tanesinin) bölünmeye ha­zırlandığını belirlemek olasıdır. Sözgelimi, bir hücre prote­ininin hücrenin neresinde sentezlendiğini ve salgılanıp sal­gılanmadığını ve salgılanırken hangi yolu izlediğini araştır­mak isteyen bir araştırmacının yapması gereken, çok sayıda hayvana radyoaktif aminoasit enjekte ederek, bunları değişik zamanlarda öldürmektir. Deney sırasında farklı zaman dilimlerinde öldürülen hayvanlardan hazırlanan kesitlerin otoradyografileri radyoaktif proteinlerin göçünü ortaya ko­yacaktır. Bir organın hangi bölümünde yeni hücre sentezi­nin gerçekleştiğini ve bu hücrelerin nereye göç ettiğini araş­tıracak olan bir araştırmacının yapması gereken de yine bir­çok hayvana radyoaktif timidin enjekte ettikten sonra, farklı zamanlarda bu hayvanları öldürmektir. Hazırlanan kesitlerin otoradyografisi hücrelerin nerede bölündüklerini ve (eğer öyleyse) nereye göç ettiklerini gösterecektir