Canlı hücreler vücut dışında da
çoğaltılıp, üzerinde çalışılabilir. Karmaşık bir organizmada, dokular ve
organlar birkaç çeşit hücreden oluşur. Bu hücreler, yüzlerce farklı molekül
içeren kan plazması içinde yıkanmaktadır. Hücre ve doku kültürü bir molekülün
tek bir hücre ya da doku üzerindeki etkilerini belirlemede çok yararlı
olmuştur. Aynı zamanda canlı hücrelerin davranışlarını mikroskop altında
doğrudan gözlemlemeye olanak tanır. Canlı hayvanda gerçekleştirilemeyen birçok
deney in vitro gerçekleştirilebilir.
Hücreler ve dokular belli bileşimlerin (tuzlar,
aminoasit- ler, vitaminler) çözeltisi içinde çoğaltılır ve buna sık olarak
serum bileşenleri eklenir. Bir doku ya da organdan kültür hazırlanırken, ilk
olarak hücrelerin mekanik olarak ya da dokuyu enzimlerle işleyerek
ayrıştırılması gerekir. Hücreler yalıtıldıktan sonra, süspansiyon halinde ya
da bir Petri kutusu veya lam gibi üzerine genellikle tek tabaka halinde
yayılabilecekleri bir zeminde çoğaltılırlar (.Şekil 1-13). Bu yolla yalıtılan
hücre kültürlerine birincil
hücre kültürleri denir. Normal ve patolojik
dokulardan bu şekilde yalıtılan pek çok hücre tipi
ölümsüzleştirilerek, bunlardan in vitro olarak sonsuza dek çoğaltılabilen
kalıcı birer hücre hattı oluşturulmuştur. Normal dokulardan elde edilen
hücrelerin büyük bir bölümü genetik olarak programlanmış olan sınırlı bir yaşam
süresine sahiptir. Bununla birlikle, belli değişiklikler (esas olarak onkogenler-
le ilişkili; bkz., 3. Bölüm) hücrenin ölümsüzleşmesini sağlayabilir, bu sürece
dönüşüm
(transformasyon) denir. Dönüşüm ve kültür teknolojisinde
sağlanan başka ilerlemeler sayesinde günümüzde çoğu hücre tipi laboratuarda
sınırsız biçimde elde edilebilmektedir. Canlı hücreler ve dokularla
gerçekleştirilen işlemlerin tümünün mikropsuz bir bölümde, steril çözeltiler ve gereçler kullanılarak yürütülmesi gerekir.
Hücre kültürü normal hücrelerin ve kanserli hücrelerin metabolizma
çalışmalarında ve yeni ilaçların geliştirilmesinde yaygın biçimde kullanılmıştır.
Bu teknik, virüsler, mikoplazma ve bazı proto- zoonlar gibi yalnız hücre içinde
çoğalan parazitlere yönelik çalışmalarda da yararlı olmaktadır (Şekil 1-13).
Sitogenetik araştırmalarda, insan karyotiplerinin (bireyin kromozomlarının sayı
ve morfolojisinin) belirlenmesi, deri fibroblastlarının ya da kan
lenfositlerinin kısa süreli kültürü ile gerçekleştirilir. Genetik bozukluklar
olarak adlandırılan çok sayıda hastalığa tanı koymak için, doku kültüründeki
hücreler mitoz bölünme anında incelenerek, bu hastalıklarla ilişkili olduğu
gösterilmiş olan kromozom sayıları ve morfolojilerindeki anormallikler
saptanabilmektedir. Buna ek olarak, hücre kültürü moleküler biyoloji ve rekombi-
nan DNA teknolojisinde kullanılan çağdaş tekniklerin temelinde yer almaktadır.
.
.
Hücrelerin ve dokuların oıganelleri ve diğer bileşenleri
hücre parçalanması ile ayrılabilir. Bu işlem, orgaııelleri ve hücre
bileşenlerini çöktürme katsayılarına göre ayrıştırmak için merkezkaç gücünün
kullanıldığı fiziksel bir yöntemdir. Bir partiküliin çöktürme katsayısı,
büyüklüğüne, şekline, yoğunluğuna ve ortamın kıvamına bağlıdır. Bu tekniklerle
elde edilen organellerin saf olup olmadığı elektron mikroskopta
araştırılabilir (Şekil 1-15), kimyasal bileşimleri ve işlevleri in vitro
çalışılabilir.
Histokimya ve sitokimya terimleri esas olarak doku kesitlerindeki farklı maddelerin yerini saptamaya yarayan yöntemleri ifade etmektedir. Bu tür bir bilgiyi elde etmek için birçok yöntem kullanılmaktadır, bu işlemlerin büyük bölümü özgün kimyasal tepkiye ya da makromolekiiller arasındaki yüksek çekimli etkileşimlere dayanmaktadır. Her iki yöntem de çoğunlukla ışık ya da elektron mikroskobu ile özgün maddelerin yerinin saptanmasını sağlayan, çözünmeyen renkli ya da elektron yoğun bileşiklerin oluşmasını sağlar.
Birçok iyonun (ör. demir, foslat) dokudaki yeri koyu renk,
çözünmez bir ürün oluşturan kimyasal tepkimelerin gerçekleştiği bu yöntemlerle
belirlenmiştir (Şekil 1-16).
Hücre çekirdeği içindeki DNA’nın yeri ve miktarı DNA varlığında
kırmızı renk oluşturan Feulgen tepkimesi ile saptanır. DNA ve RNA, doku
kesitlerinin bazik bir boya ile boyanmasıyla da analiz edilebilir. Nükleik
asillerin varlığına bağlı bazofilİ, kesitlerin DNAaz ya da RNAaz enzimi ile önceden
sindirime tabi tutulmasıyla ortadan kaldırılabilir.
Doku kesitlerinde proteinleri
saptamaya dönük genel yöntemler bulunmasına karşın, histomyasal yöntemler,
hücre ve dokulardaki özel proteinlerin yerlerinin belirlenmesine genelde olanak
tanımazlar. Bu bölümün son kısımlarında da görüleceği gibi, bunun
yapılabilmesi immünlıistokimya İle olasıdır.
Bununla birlikte, büyük bir protein
grubu olan enzimleri az çok özgül biçimde göstermek üzere kullanılan birkaç
histokimya yöntemi bulunmaktadır. Söz konusu yöntemlerde genellikle enzimlerin
özgül kimyasal bağlarla tepkime oluşturma sığalarından yararlanılır.
Histoenzimatik yöntemlerin çoğu şu biçimde iş göriir: (!) doku kesitleri
çalışılmak istenen enzimin alt kalınanını (siibstrat) içeren bir çözeltiye
batırılır; (2) enzimin alı katmanla etkileşmesi sağlanır; (3) yöntemin bu
aşamasında ya da daha sonra, kesit üzerine belirteç bileşik konur; (4) bu
bileşik alt katmanın bozunnıası ya da dönüşmesi sonucu oluşan molekülle
tepkimeye girer; (5) enzimin bulunduğu bölgenin üzerinde, çözünmez olması
gereken ve renkli ya da elektron yoğun olması durumunda ışık ya da elektron
mikroskop ile görülebilen son tepkime ürünü çökeltileri oluşur. Bu tür bir
kesit mikroskopla incelendiğinde, hücreler (ya da organeller) renkli ya da
elektron yoğun bir madde ile kaplı olarak görünür.
Saptanabilen bazı enzim örnekleri şu
şekilde sıralanabilir:
Fosfatlar, vücutta yaygın olarak bulunan
enzimlerdir. Fosforillenmiş moleküllerde fosfat grubu ile alkol kökü arasındaki
bağı koparırlar. Fosfatazların renkli, çözünmez tepkime ürünü genellikle
kurşun fosfat ya da kurşun siilfittir. En yüksek işlevini alkali pH’da gösteren
alkali fosiatazlar saptanabilir (Şekil 1-17). Asit fosiatazlar sık olarak,
asit fosfataz içeren sitoplazma organelleri olan lizozomları göstermek için
kullanılır (Şekil 1-18).
Delıidrojenazlar, hidrojeni bir alt katmandan alıp, bir
başkasına aktarır. Vücutta birçok lıidıojenaz bulunmaktadır ve bunlar,
metabolik işlemlerde önemli rol üstlenirler. De- hidrojenazlar histokimyasal
olarak, tespit edilmemiş doku kesitlerinin hidrojeni alıp, çözünmeyen, renkli
bir bileşik halinde çöküntü oluşturan bir molekül içeren katman bileşiğinde
inkübe edilmesiyle saptanabilmektedir. Bu yöntemle siiksinat
dehidrojenazın-sitrik asit (Krebs) döngüsünde önemli bir enzim-mitokondri
içindeki yeri belirlenebilir.
Bir çok hücre tipinde bulunan peroksidaz, hidrojen iyonlarını hidrojen
perokside aktararak belli substratların oksitlenmesini ve su moleküllerinin
oluşmasını sağlayan bir enzimdir.
Bu yöntemde, yeterince tespit edilmiş
olan doku kesitleri hidrojen peroksit ve 3,3-dİaminobetızidin içeren bir çözeltide
bekletilir. Diaminobenzidin peroksidazın varlığında okside olarak, ışık ve
eleklronmikroskopta peroksidaz aktivite- sinin bulunduğu yeri belirlememizi
sağlayacak olan kahverengi, çözünmez, elektron yoğun bir çökelti oluşturur.
Kan hücrelerindeki peroksidaz etkinliği lösemilerin tanısı açısından önemlidir
ve bu yöntemle saptanabilmektedir.
Peroksidaz çok aktif olduğu ve çok kısa sürede büyük
miktarda çözünmez çökelti oluşturduğundan, başka bileşiklerin işaretlenmesi
uygulamasında önemli bir kullanım akını bulmaktadır. Peroksidaz molekülleri
saflaştırılabilir, yalıtıla- bilir ve başka bir molekülle eşleştirilebilir. Bu
bölümün ilerisinde moleküllerin peroksidazkı işaretlenmesi uygulamaları
açıklanmaktadır.
Vücuttaki polisakkaritler ya serbest ya da
proteinlerle ve lipitlerle birleşik halde bulunurlar. Birleşik oldukları
durumda aşırı karmaşık farklı cinsten bir grup oluştururlar. Bunlar, şekerlerde
bulunan 1,2 glikol gruplarını aldehid köklerine dönüştürmeye dayanan periyodik
asid-Schİff (PAS) tepkimesi ile gösterilebilir. Daha sonra bu kökler Schiff
belirteci ile ortaya konur, .söz konusu belirteç
kesitte, polisakkariilerin toplandığı bölgelerde mor ya da kırmızı renk verir.
FAS tepkimesi ile, vücutta çok yaygın
ve bol olarak bulunan serbest bir polisakkarit olan glikojen karaciğerde, iskelet kasında ve
biriktiği başka dokularda gösterilebilmektedir.
Glikoproteinler, küçük, dallanmış şeker zincirleriyle
(oligosakkaritler) ilişkili protein molekülleridir. Protein zinciri
oligosakkarit zincirinin ağırlığında ve hacminde etkin rol oynar. Bazı
glikoproteinler asil grubu içermeyip (nötral glikoproteinler), PAS pozitif iken,
diğerlerinde sınırlı miktarda karboksil ya da sülfat kökleri bulunur. Hem glikojen,
hem de nötral glikoproteinler PAS pozitif olduklarından, PAS tepkimesinin
özgüllüğünü değerlendirmek için normal kesitlerdeki boyanma ile glikojeni
parçalayan bir enzimle (ör., tükürük amilazı) ön işleme tabi tutulan
kesitlerdeki boyanma karşılaştırılabilir. Glikojen içeren yapılar PAS tepkimesi
ile yoğun olarak boyanır, ancak amilazla ön işlem yapıldığında boyanma olmaz.
Şekil 1-19’da PAS tepkimesi ile boyanan yapı örnekleri gösterilmektedir.
Lipitler en iyi şekilde, lipit içinde çözünebilen boyalarla gösterilirler. Bu yöntemde, dondurulmuş kesitler, uygun boyalarla doyurulmuş alkolik çözeltiler içine daldırılır. Sonra boya, alkolden hücresel lipid damlacıklarına doğru güç eder. Bu amaçla en çok Sudan IV ve Sudan siyahı boyaları kullanılır. Boya hücredeki lipit damlacıkları içinde çözülerek kırmızı ya da siyaha boyar. Kolesterol ve kotesterol esterleri, fosfolipler ve glikolipidlerin belirlenmesi için kullanılan ek yöntemler, farklı tür lipkllerin hücre içine biriktiği metabolik hastalıkların tanısında yararlıdır.
Laboratuvar tanıda demir için Perls
reaksiyonu, glikojen ve glikozaminglikanlar için PAS-amilaz ve alsiyan mavisi
tepkimesi gibi pek çok histokimya- sal yöntem sık olarak kullanılır. Lipitlere
yönelik tepkimeler rutin olarak dokularda demir (hemok- romatoz, hemosideroz,
glikojen (glikojenoz), glikozaminglikanlar (mukopolisakkaridoz) ve sfingo-
lipidler (sfingolipidoz) birikimine yol açan bir hastalığı bulunan hastalardan
alınan doku biyopsilerinde lipit reaksiyonları rutin olarak kullanılır.
Bir doku kesitinde bulunan özgül bir molekül, o molekül ile
özel olarak etkileşen bileşikler kullanılarak saptanabilir. Molekülle
etkileşecek olan bileşiklerin ışık ya da elektron mik roskopu ile belirlenebilecek olan bir
belirteçle işaretlenmesi gerekir (Şekil 1-20). En sık kullanılan belirteçler
floresan bileşikler (floresan ya da lazer mikroskopu ile görülebilir),
radyoaktif atomlar (otoradyografi ile saptanabilir), peroksidaz molekülleri
(hidrojen peroksit ve 3,3-diaminobenzidin ile enzim gösterildikten sonra
saptanabilir) ya da başka enzimler (ilgili sübstratlarıyla saptanabilir) ve
ışık ve elektron mikroskopunda görülebilen metal (genellikle altın) parçacıklarıdır.
Bu yöntemler genellikle şekerleri, proteinleri ve nükleik asitleri saptamada
kullanılır.
Diğer moleküllerle özgül olarak
etkileşen bileşiklere örnek olarak falloidin, protein A, lektinler ve antikorlar
gösterilebilir.
Bir mantardan (Amanita phalloides)
elde edilen falloidin, aklinle güçlü bir biçimde etkileşim gösterir ve genellikle
mik- rofilamanları göstermek için floresan boyalarla işaretlenir.
Staphylococcus aureus’tan elde edilen
bir protein olan protein A immünglobulin molekülünün (antikor) Fc bölgesine bağlanır.
Protein A bir belirteçle işaretlendiğinde im- münglobulinler saptanabilir (bkz.
İmmiinohistokimya).
Lektinler, esas olarak bitki tohumlarından
türetilen proteinler ya da glikoproteinlerdir ve yüksek bir çekim ve özgüllükle
karbonhidratlara bağlanırlar. Farklı lektinler özgül şekerlere ya da şeker
kalıntı dizilerine bağlanırlar. Lektinler, glikoproteinlere, proteoglikanlara
ve glikolipitlere bağlanırlar ve özgül şeker kalıntı dizilerini içeren zar
moleküllerini betimlemek için yaygın olarak kullanılırlar.
Moleküller arasında yüksek düzeyde
özgül etkileşimlerden birisi de antijen ile antikor arasında gerçekleşir. Bu
nedenle özgül proteinlerin yerini belirlemede en büyük yararı işaretli
antikorların kullanıldığı yöntemlerin sağladığı kanıtlanmıştır. Vücutta, kendi
(öz) moleküllerini yabancı moleküllerden ayırt edebilen hücreler bulunmaktadır.
Vücut, yabancı moleküllerle—antijenlerle—karşılaştığında, bunlarla özgül olarak
etkileşen ve antijene bağlanan proteinler—antikorlar— üreterek yabancı maddenin ortamda
etkisiz kılınmasına yardımcı olur. Antikorlar, immünglobulin olarak adlandırılan büyük bir aileye
ait proteinlerdir.
İmmünohistokimyada, belli bir
proteini barındırabileceği düşünülen doku kesiti (ya da kültürde çoğaltılmış
olan hücreler) bu proteinin antikorunu içeren bir çözelti içinde kuluçkalanır (inkübasyon). Antikor, özgül olarak bu proteine bağlandıktan sonra,
antikoru işaretlemek üzere kullanılan bileşiğin tipine bağlı olarak, ışık ya da
elektron mikroskop ile söz konusu proteinin yeri belirlenebilir.
İmmiinhistokimya için gereken en
önemli koşullardan birisi, belirlenecek olan proteine karşı bir antikomn
bulunmasıdır. Yani, proteinin daha önceden saflaştırılarak ayrılması, bu şekilde
antikorların üretilebilmesi gerekir. Şekil 1-21 ve 1-22’de proteinlerin
ayrılmasına ilişkin bazı yöntemler gösterilmektedir.
POLİKLONAL VE MONOKLONAL ANTİKORLAR
Amacımızın, belli hayvan türlerinin
(örneğin sıçan ya da insan) x proteinine karşı antikorlar üretmek olduğunu
varsayalım. X proteini daha önce yalıtılmış ise, başka bir türe (ör., tavşan
ya da keçi) enjekte edilir. Söz konusu protein bu hayvan için yabancı—yani
antijen—olarak algılanacak kadar farklıysa, hayvan, bu proteine karşı
antikorlar üretecektir (ör., sıçan x’ine karşı tavşan antikoru ya da insan x’ine karşı keçi
antikoru). Bu antikorlar, hayvanın plazmasından toplanır ve immiinohistokimya
için kullanılır.
X proteini enjekte edilen hayvanların
birkaç lenfosit grubu (klonu) x proteininin farklı bölgelerini tanıyabilir ve
her bölüme karşı farklı antikor üretebilir. Bu antikorlar poliklo- nal
antikorlardan oluşan
bir karışım oluştururlar.
Bununla birlikte, x proteinini hücre
kültüründe yaşatılan lenfositlere (aslında tümör hücrelerine tutunmuş
lenfositler) yönelik olarak elde etmek de olasıdır. Farklı lenfosit klonla- rı
x proteininin birkaç bölümüne karşı farklı antikorlar üretecektir. Her klon, x
proteinine karşı farklı antikorlar ayrı olarak toplanabilecek şekilde
birbirinden ayrı olarak yalıtıla- bilir ve kültürde yaratılabilir. Bu
antikorların her biri bir monoklonal antikordur. Monoklonal antikor kullanımının, poliklonal antikor kullanımına göre bir çok
avantajı bulunmaktadır: söz gelimi, belirlenmek istenen proteine karşı yüksek
düzeyde özgül ve buna güçlü bir biçimde bağlanacak monoklonal bir
antikor seçilebilir. Bu yüzden, özgül olmayan başka proteinlerin, x
proteininin saptanmasını güçleştirebilecek biçimde bağlanması engellenmiş
olur. Doğrudan immünohistokimya
yönteminde, antikorun (ister monoklonal, ister poliklonal) uygun bir etiketle işaretlenmesi
gerekir. Doku kesitleri, x’e karşı işaretlenmiş antikorla kuluçkalanır, antikor
özgül olarak etkileşime girer ve x proteinine bağlanır. Bağlanmayan antikoru
uzaklaştırmak amacıyla kesit yıkanır (Şekil 1-23). Kullanılan işaretleyi-olarak peroksidaz ya da başka bir enzim
kullanılması durumunda doku kesiti mikroskopla incelenmeden önce enzimin
saptanması gerekir (bkz. Histokim- ya ve Sitokimya). Doku kesitinde x
proteinini içeren alanlar belirteç enzimin varlığına bağlı olarak lloresan özellik
kazanacak ya da üzeri altın parçacıklarıyla veya koyu renk bir çökelti ile
kaplanacaktır.
Dolaylı
immünohistokimya yöntemi daha duyarlıdır ancak daha fazla basamak içerir. Sıçanlarda
bulunan bir x proteinini saptamak istediğimizi varsayalım. İmmiinohistokimya-
sal reaksiyona yönelmeden önce iki işlemin gerçekleştirilmesi gerekin (1)
öncelikle başka bir hayvan türünde (ör., tavşan), sıçan x proteinine karşı
antikorların üretilmesi gerekir; (2) bu işleme koşut olarak, normal (enjeksiyon
yapılmamış) bir tavşandan alınan immünglobulinin üçüncü bir hayvan türüne
(ör., koyun ya da keçi) enjekte edilmesi gerekir. Tavşan immünglobulinleri
koyun ya da keçi tarafından yabancı olarak benimsenir ve bu nedenle o hayvanda
antikor (anti-anti- kor ya da anti-immiinoglobulin) oluşturma niteliğine
sahiptir.
Dolaylı immiinohistokimyasal saptama yönteminde ilk olarak x proteini
içerdiğine inanılan sıçan dokusu kesiti tavşan anti-x antikoru ile
kuluçkalanır. Yıkamadan sonra doku kesitleri tavşan antikorlarına karşı
işaretlenmiş koyun ya da keçi antikorları ile kuluçkalanır. Anti-antikorlar x
proteinini tanımış olan tavşan antikorlarını tanıyacaktır (Şekil 1-24). X
proteini, ikincil antikorda kullanılan belirtece uygun mikroskobik teknik
kullanılarak saptanabilir. Avidin-biyotin tekniği gibi diğer ara moleküllerin
kullanıldığı başka dolaylı yöntemler de bulunmaktadır.
Şekil 1-21. Protein
yalıtma yöntemleri olan ultrasantrifüj (A)
ve kromatog- rafi (B).
A: Homojenize edilen hücrelerden ya da dokulardan elde edilen protein
karışımı birkaç saat boyunca yüsek hızda çevrilir. Proteinler moleküllerin
büyüklüğüne ve yoğunluğuna bağlı olarak birkaç banda ayrılır. Ultrasantrifüj
medyumu süzülerek daha sonra analiz edilebilecek biçimde farklı proteinleri
içeren birkaç fraksiyon halinde toplanır. B:
Homojenize edilen hücrelerden ya da dokulardan elde edilen protein
karışımını içeren çözelti, farklı kimyasal özelliklere sahip parçacıklarla dolu
olan bir kolon içine konur. Sözgelimi bu parçacıklar farklı elektrostatik
yüklere (proteinleri yüklerine göre çeken) ya da farklı boyda gözeneklere
(farklı boy molekülleri geçiren elek işlevi gören) sahip olabilir.
Proteinlerin sütundan geçişi sırasında parçacıklarla etkileşimlerine göre
hareketleri yavaşlar. Akış tamamlandığında, farklı protein grupları ayrı
olarak toplanabilir.
İmmünositokimya,
hücre biyolojisindeki araştırmalara ve tıbbi tanı yöntemlerinin
geliştirilmesine somut olarak katkıda bulunmaktadır Şekil 1- 25'ten 1-28’e dek
molekülleri immünohistokimya- sal olarak saptama yöntemlerine ilişkin örnekler
gösterilmektedir. Tablo 1-1'de klinik uygulamada kullanılan immünositokimyasal
yöntemlerin bazı alışılmış uygulamaları gösterilmektedir
İN SiTU HİBRİDIZASYON
Söz konusu teknik hücrelere ve doku kesitlerine, yaymalara
ya da mitozda dağılmış kromozomlara doğrudan uygulandığında, in situ
hibridizasyon adını alır. Bu teknik hücrede öz gül bir DNA dizisi (bir gen ya da
genin bir bölümü) bulunması durumunda, özgül bir genin okunduğu hücrelerin hangileri
olduğunu belirlemek ya da özgül bir kromozomda bulunan bir genin yerini
saptamak için idealdir. İlk olarak hücre içindeki DNA’nın ısı ya da doğasını
bozucu maddeler kullanılarak denatüre edilip, iki DNA iplikçiğinin birbirinden
ayrılması gerekir. Daha sonra bu iplikçikler, tek iplik üzerinde belirlenmek
istenen dizinin karşılığını taşıyan DNA ya da RNA parçacığı ile
“hibridleştirilmeye" hazır hale gelir. Bu diziye prob adı verilir. Prob, klonlanarak, hedef
diziyi PCR ile çoğaltarak ya da istenen dizi kısaysa sentezleyerek elde edilebilir.
Probun, genellikle radyoaktif bir izotop (otoradyog- rafi ile saptanabilir) ya
da immünohiztokimya ile belirlenebilen değiştirilmiş bir nuikleotid
(digoksigenin) gibi bir işaretleyici ile işaretlenmesi gerekir.hücreler, yaymalar ya da mitoz
sırasında patlatılmış olan hücrelerin kromozomlarının ısıtılarak çift sıralı
DNA’larının ayrılması gerekir. Daha sonra örneğin üzerine hibridizasyon için
gereken süre boyunca probu içeren çözelti konur. Probun fazlası yıkandıktan
sonra, taşıdığı işaret aracılığıyla tutunmuş olan probun yeri belirlenir
(Şekil 1-29).
Şekil 1-22. Jel elektroforezi: Protein ayırma
yöntemidir. A: Proteinlerin ayrılması. (1) Homojenize edilen hücrelerden ya da
dokulardan protein karışımları elde edilir. Protein alt birimlerini açmak ve
birbirinden ayırmak için genellikle güçlü bir deterjan (sodyum dodesil sülfat)
ve merkaptoetanol ile işlem yapılır. (2) Örnekler elektriksel alan oluşturulan
poliakrilamid jel havuzlarına konur. Proteinler boyutlarına ve şekillerine göre
jel içinde hareket eder. (3) Jel üzerine, diğer proteinlerin molekül kütlesini
belirlemek üzere olarak molekül ağırlığı bilinen (referans) proteinlerden
oluşan bir karışım eklenir. B: Proteinlerin saptanması ve belirlenmesi. (1)
Boyama. Tüm proteinler aynı renk boyanır. Renk yoğunluğu protein derişimi ile
doğru orantılıdır. (2) Otorad- yografi. Radyoaktif proteinler otoradyografi ile
saptanabilir. Jel üzerine belli bir süreyle röntgen filmi konur ve sonra bu
film banyo edilir. Radyoaktif proteinler film üzerinde koyu renk bandlar
biçiminde görünecektir. (3) İmmün işaretleme. Proteinler jelden, nitroselüloz
bir zar üzerine aktarılabilir. Bu zar, örnekte bulunabilecek antijenlere karşı
oluşturulan antikor ile inkübe edilir.
Hibridizasyon, katı ortamlarda
saflaştırılmış DNA ya da RNA ile de gerçekleştirilebilir. Niikleik asit
karışımları agar jeli ya da poliakrilamid jeli içinde elektrolorezle ayrılır.
Poli- akrilamid jeli daha yüksek düzeyde çözümlemeye olanak tanır.
Elektroforezden sonra, farklı boylardaki nükleilc asit molekülleri naylon ya
da nitroselüloz yaprağına aktarılır: kapi- ler etkiyle, jel ile zar arasından
naylon ya da nitroselüloz yaprağına yeğin bir biçimde tutunacak olan nükleik
asit moleküllerini taşıyan bir tampon geçirilir. Nükleik asitler bu yapraklar üzerinde ayrıntılı olarak
analiz edilebilir. Bu DNA saptama tekniğine Southern belirtimi adı verilir. RNA
elektroforezi gerçekleştirildiğinde, teknik Northern belirtimi adını alır.
Hibridizasyon teknikleri yüksek
düzeyde duyarlıdır ve araştırma, klinik tanı ve adli tıp alanında rutin olarak
kullanılmaktadır.
Hibridizasyon teknikleri yüksek
düzeyde duyarlıdır ve araştırma, klinik tanı ve adli tıp alanında rutin olarak
kullanılmaktadır.
Mikroskop preparatlarında, boyanmış doku
kesitlerinin çalışılması ve yorumlanması sırasında incelenen örneğin, esas
olarak tespit ile başlayıp, boyama ile sona eren bir dizi işlemden sonra elde
edilen en son ürün olduğu unutulmamalıdır. Doku takibi işleminin bir çok
basamağı dokuların görünümünü bozarak canlı lıaldekinden daha farklı görünüm
oluşmasına neden olabilir. Bu bozulmaya yol açan nedenlerden biri tespit
edici, etanol ve parafine gömme için gereken ısıtma işlemine bağlı büzülmedir.
Doku örnekleri reçineye gömüldüğünde bu olumsuzluklar azaltılabilir.
Bu uygulamaların bir sonucu olarak
çoğu kez yapay olarak hücreler ve diğer doku bileşenleri arasında boşluklar ortaya
çıkar. Yapay boşluklarını oluşturan başka bir neden de tespit maddesinin doku
İçinde düzgün biçimde tespit edemediği moleküllerin kaybolması ya da su alıcı
ve saydamlaştırıcı sıvılar tarafından bulunduğu yerden uzaklaştırılmasıdır.
Kesitlerin doku takibi işlemleri sırasında yapay
olarak ortaya çıkan tüm bu boşluklara ve diğer bozuk görüntülere artefakt (kusur) denir. Başka
kusurlar arasında kesitin katlanması (kılcal kan damarı ile karıştırılabilir),
boya çökeltileri (sitoplazmik graniillerle karıştırılabilir) ve başkaları
sayılabilir. Öğrencilerin, kesitlerde kusur olabileceğini bilmeleri ve bunları
yanılmaksızın tanımaları gerekir
Histolojik kesitlerin çalışılması sırasında karşılaşılan
başka bir güçlük de tüm doku bileşenlerinin sadece tek bir lam üzerinde farklı
olarak boyanmasının mümkün olmamasıdır. Işık mikroskopta incelenen hücrelerin
çekirdeklerini, mito- kondrilerini, Iizozomlarını ve peroksizomlarını,
hücreleri çevreleyen bazal membranın yanı sıra kolajen, elastik ve re- tiküler
lifleri görmek neredeyse olanaksızdır. Herhangi bir dokunun tüm bileşimi ve
yapısı hakkında genel bir fikir elde edinmeden önce, her biri farklı yöntemle
boyanmış birkaç preparatın incelenmesi gerekmektedir. Öte yandan, transmisyon
elektron mikroskobu hücreyi tüm organelleriy- le, inklüzyonlarıyla ve
çevresindeki hücre dışı matriks bileşenleriyle gözlemleyebilmemizi sağlar.
Üç boyutlu bir yapı çok ince kesildiğinde, kesitler en ve
boy olarak yalnızca iki boyuta sahip gibi gözlenir. Bu durum, kesite bakan
kişinin dokuda küre şeklindeki bir yapının kesitte daire, tüp yapısının ise
halka şeklinde göründüğünü anlamaması durumunda yanıltıcı olur (Şekil 1-30).
Mikroskopta bir kesit incelenirken, pek çok yapı kesitten daha kalın olduğundan,
kesitin arkasında ya da önünde bir şeylerin gözden kaçabileceği
düşünülmelidir. Aynı zamanda, bir dokunun içindeki yapıların gelişigüzel
kesildiğini de unutmamak gerekir.
Alberts B et al: Molecular Biology of the Cell, 3rd ed. Garland, 1994.
Bancroft JD, Stevens A: Theory and Practice of
Histological Techniques, 2nd ed.
Churchill Livingstone, 1990.
Cuello ACC: Immunocytochemistry. Wiley, 1983.
Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular Cell Biology, 2nd ed. Scientific American Books, 1990.
Hayat MA: Stains and Cytochemical
Methods. Plenum, 1993.
James J: Light Microscopic
Techniques in Biology and Medicine. Martinus Nijhoff, 1976.
Junqueira LCU et al: Differential staining of collagen
types I, II and III by Sirius Red and polarization
microscopy. Arch Histol Jpn
1978;41:267.
Meek GA: Practical Electron Microscopy fir Biologists. Wiley, 1976.
Pease AGE: Histochemistry: Theoretical and Applied, 4 th ed. Churchill
Livingstone, 1980.
Rochow TG, Tucker PA: Introduction to
Microscopy by Means of Light, Electrons, X Rays, or
Acoustics. Plenum Press, 1994.
Rogers AW: Techniques of Autoradiography, 3rd ed. Elsevier, 1979.
Rubbi CP: Light Microscopy. Essential Data
. Wiley, 1994.
Spencer
M: Fundamentals of Light
Microscopy. Cambridge Univ Press, 1982. Stoward PJ,
Poiak JM (editors): Histochemistry:
The Widening Horizons of Its Applications in Biological Sciences.
Wiley, 1981.
Yorumlar
Yorum Gönder