Hücre Ve Doku Kültürü Nasıl Yapılır

Canlı hücreler vücut dışında da çoğaltılıp, üzerinde çalışılabilir. Karmaşık bir organizmada, dokular ve organlar birkaç çeşit hücreden oluşur. Bu hücreler, yüzlerce farklı molekül içeren kan plazması içinde yıkanmaktadır. Hücre ve doku kültürü bir molekülün tek bir hücre ya da doku üzerindeki etkilerini belirlemede çok ya­rarlı olmuştur. Aynı zamanda canlı hücrelerin davranışlarını mikroskop altında doğrudan gözlemlemeye olanak tanır. Canlı hayvanda gerçekleştirilemeyen birçok deney in vitro gerçekleştirilebilir.
Hücreler ve dokular belli bileşimlerin (tuzlar, aminoasit- ler, vitaminler) çözeltisi içinde çoğaltılır ve buna sık olarak serum bileşenleri eklenir. Bir doku ya da organdan kültür ha­zırlanırken, ilk olarak hücrelerin mekanik olarak ya da doku­yu enzimlerle işleyerek ayrıştırılması gerekir. Hücreler yalıtıl­dıktan sonra, süspansiyon halinde ya da bir Petri kutusu ve­ya lam gibi üzerine genellikle tek tabaka halinde yayılabile­cekleri bir zeminde çoğaltılırlar (.Şekil 1-13). Bu yolla yalıtılan hücre kültürlerine birincil hücre kültürleri denir. Normal ve patolojik dokulardan bu şekilde yalıtılan pek çok hücre ti­pi ölümsüzleştirilerek, bunlardan in vitro olarak sonsuza dek çoğaltılabilen kalıcı birer hücre hattı oluşturulmuştur. Normal dokulardan elde edilen hücrelerin büyük bir bölümü genetik olarak programlanmış olan sınırlı bir yaşam süresine sahiptir. Bununla birlikle, belli değişiklikler (esas olarak onkogenler- le ilişkili; bkz., 3. Bölüm) hücrenin ölümsüzleşmesini sağla­yabilir, bu sürece dönüşüm (transformasyon) denir. Dö­nüşüm ve kültür teknolojisinde sağlanan başka ilerlemeler sayesinde günümüzde çoğu hücre tipi laboratuarda sınırsız biçimde elde edilebilmektedir. Canlı hücreler ve dokularla gerçekleştirilen işlemlerin tümünün mikropsuz bir böl
ümde, steril çözeltiler ve gereçler kullanılarak yürütülmesi gerekir.








Hücre kültürü normal hücrelerin ve kanserli hücrelerin metabolizma çalışmalarında ve yeni ilaç­ların geliştirilmesinde yaygın biçimde kullanılmış­tır. Bu teknik, virüsler, mikoplazma ve bazı proto- zoonlar gibi yalnız hücre içinde çoğalan parazit­lere yönelik çalışmalarda da yararlı olmaktadır (Şekil 1-13). Sitogenetik araştırmalarda, insan karyotiplerinin (bireyin kromozomlarının sayı ve morfolojisinin) belirlenmesi, deri fibroblastlarının ya da kan lenfositlerinin kısa süreli kültürü ile gerçekleştirilir. Genetik bozukluklar olarak adlan­dırılan çok sayıda hastalığa tanı koymak için, do­ku kültüründeki hücreler mitoz bölünme anında incelenerek, bu hastalıklarla ilişkili olduğu göste­rilmiş olan kromozom sayıları ve morfolojilerinde­ki anormallikler saptanabilmektedir. Buna ek ola­rak, hücre kültürü moleküler biyoloji ve rekombi- nan DNA teknolojisinde kullanılan çağdaş teknik­lerin temelinde yer almaktadır.
.
.

Hücrelerin ve dokuların oıganelleri ve diğer bileşenleri hüc­re parçalanması ile ayrılabilir. Bu işlem, orgaııelleri ve hüc­re bileşenlerini çöktürme katsayılarına göre ayrıştırmak için merkezkaç gücünün kullanıldığı fiziksel bir yöntemdir. Bir partiküliin çöktürme katsayısı, büyüklüğüne, şekline, yo­ğunluğuna ve ortamın kıvamına bağlıdır. Bu tekniklerle el­de edilen organellerin saf olup olmadığı elektron mikros­kopta araştırılabilir (Şekil 1-15), kimyasal bileşimleri ve işlev­leri in vitro çalışılabilir.

Histokimya ve sitokimya terimleri esas olarak doku kesit­lerindeki farklı maddelerin yerini saptamaya yarayan yön­temleri ifade etmektedir. Bu tür bir bilgiyi elde etmek için birçok yöntem kullanılmaktadır, bu işlemlerin büyük bölümü özgün kimyasal tepkiye ya da makromolekiiller arasındaki yüksek çekimli etkileşimlere dayanmaktadır. Her iki yöntem de çoğunlukla ışık ya da elektron mikroskobu ile özgün maddelerin yerinin saptanmasını sağlayan, çözünmeyen renkli ya da elektron yoğun bileşiklerin oluşmasını sağlar.


Birçok iyonun (ör. demir, foslat) dokudaki yeri koyu renk, çözünmez bir ürün oluşturan kimyasal tepkimelerin gerçek­leştiği bu yöntemlerle belirlenmiştir (Şekil 1-16).


Hücre çekirdeği içindeki DNA’nın yeri ve miktarı DNA var­lığında kırmızı renk oluşturan Feulgen tepkimesi ile sapta­nır. DNA ve RNA, doku kesitlerinin bazik bir boya ile bo­yanmasıyla da analiz edilebilir. Nükleik asillerin varlığına bağlı bazofilİ, kesitlerin DNAaz ya da RNAaz enzimi ile ön­ceden sindirime tabi tutulmasıyla ortadan kaldırılabilir.

Doku kesitlerinde proteinleri saptamaya dönük genel yöntem­ler bulunmasına karşın, histomyasal yöntemler, hücre ve doku­lardaki özel proteinlerin yerlerinin belirlenmesine genelde ola­nak tanımazlar. Bu bölümün son kısımlarında da görüleceği gi­bi, bunun yapılabilmesi immünlıistokimya İle olasıdır.
Bununla birlikte, büyük bir protein grubu olan enzim­leri az çok özgül biçimde göstermek üzere kullanılan birkaç histokimya yöntemi bulunmaktadır. Söz konusu yöntemler­de genellikle enzimlerin özgül kimyasal bağlarla tepkime oluşturma sığalarından yararlanılır. Histoenzimatik yöntem­lerin çoğu şu biçimde iş göriir: (!) doku kesitleri çalışılmak istenen enzimin alt kalınanını (siibstrat) içeren bir çözeltiye batırılır; (2) enzimin alı katmanla etkileşmesi sağlanır; (3) yöntemin bu aşamasında ya da daha sonra, kesit üzerine be­lirteç bileşik konur; (4) bu bileşik alt katmanın bozunnıası ya da dönüşmesi sonucu oluşan molekülle tepkimeye girer; (5) enzimin bulunduğu bölgenin üzerinde, çözünmez olma­sı gereken ve renkli ya da elektron yoğun olması durumun­da ışık ya da elektron mikroskop ile görülebilen son tepki­me ürünü çökeltileri oluşur. Bu tür bir kesit mikroskopla in­celendiğinde, hücreler (ya da organeller) renkli ya da elekt­ron yoğun bir madde ile kaplı olarak görünür.
Saptanabilen bazı enzim örnekleri şu şekilde sıralanabilir:
Fosfatlar, vücutta yaygın olarak bulunan enzimlerdir. Fosforillenmiş moleküllerde fosfat grubu ile alkol kökü ara­sındaki bağı koparırlar. Fosfatazların renkli, çözünmez tep­kime ürünü genellikle kurşun fosfat ya da kurşun siilfittir. En yüksek işlevini alkali pH’da gösteren alkali fosiatazlar sapta­nabilir (Şekil 1-17). Asit fosiatazlar sık olarak, asit fosfataz içeren sitoplazma organelleri olan lizozomları göstermek için kullanılır (Şekil 1-18).
Delıidrojenazlar, hidrojeni bir alt katmandan alıp, bir başkasına aktarır. Vücutta birçok lıidıojenaz bulunmaktadır ve bunlar, metabolik işlemlerde önemli rol üstlenirler. De- hidrojenazlar histokimyasal olarak, tespit edilmemiş doku kesitlerinin hidrojeni alıp, çözünmeyen, renkli bir bileşik ha­linde çöküntü oluşturan bir molekül içeren katman bileşi­ğinde inkübe edilmesiyle saptanabilmektedir. Bu yöntemle siiksinat dehidrojenazın-sitrik asit (Krebs) döngüsünde önemli bir enzim-mitokondri içindeki yeri belirlenebilir.
Bir çok hücre tipinde bulunan peroksidaz, hidrojen iyon­larını hidrojen perokside aktararak belli substratların oksitlen­mesini ve su moleküllerinin oluşmasını sağlayan bir enzimdir.
Bu yöntemde, yeterince tespit edilmiş olan doku kesitle­ri hidrojen peroksit ve 3,3-dİaminobetızidin içeren bir çözel­tide bekletilir. Diaminobenzidin peroksidazın varlığında ok­side olarak, ışık ve eleklronmikroskopta peroksidaz aktivite- sinin bulunduğu yeri belirlememizi sağlayacak olan kahve­rengi, çözünmez, elektron yoğun bir çökelti oluşturur. Kan hücrelerindeki peroksidaz etkinliği lösemilerin tanısı açısın­dan önemlidir ve bu yöntemle saptanabilmektedir.
Peroksidaz çok aktif olduğu ve çok kısa sürede büyük miktarda çözünmez çökelti oluşturduğundan, başka bileşik­lerin işaretlenmesi uygulamasında önemli bir kullanım akını bulmaktadır. Peroksidaz molekülleri saflaştırılabilir, yalıtıla- bilir ve başka bir molekülle eşleştirilebilir. Bu bölümün ile­risinde moleküllerin peroksidazkı işaretlenmesi uygulamala­rı açıklanmaktadır.
Vücuttaki polisakkaritler ya serbest ya da proteinlerle ve li­pitlerle birleşik halde bulunurlar. Birleşik oldukları durumda aşırı karmaşık farklı cinsten bir grup oluştururlar. Bunlar, şe­kerlerde bulunan 1,2 glikol gruplarını aldehid köklerine dö­nüştürmeye dayanan periyodik asid-Schİff (PAS) tepkimesi ile gösterilebilir. Daha sonra bu kökler Schiff belirteci ile or
taya konur, .söz konusu belirteç kesitte, polisakkariilerin top­landığı bölgelerde mor ya da kırmızı renk verir.
FAS tepkimesi ile, vücutta çok yaygın ve bol olarak bulu­nan serbest bir polisakkarit olan glikojen karaciğerde, iske­let kasında ve biriktiği başka dokularda gösterilebilmektedir.
Glikoproteinler, küçük, dallanmış şeker zincirleriyle (oligosakkaritler) ilişkili protein molekülleridir. Protein zin­ciri oligosakkarit zincirinin ağırlığında ve hacminde etkin rol oynar. Bazı glikoproteinler asil grubu içermeyip (nötral glikoproteinler), PAS pozitif iken, diğerlerinde sınırlı miktarda karboksil ya da sülfat kökleri bulunur. Hem glikojen, hem de nötral glikoproteinler PAS pozitif olduklarından, PAS tep­kimesinin özgüllüğünü değerlendirmek için normal kesitler­deki boyanma ile glikojeni parçalayan bir enzimle (ör., tü­kürük amilazı) ön işleme tabi tutulan kesitlerdeki boyanma karşılaştırılabilir. Glikojen içeren yapılar PAS tepkimesi ile yoğun olarak boyanır, ancak amilazla ön işlem yapıldığında boyanma olmaz. Şekil 1-19’da PAS tepkimesi ile boyanan ya­pı örnekleri gösterilmektedir.
Glikozaminoglikanlar güçlü anyonik özellik gösteren, aminli monosakkaritler (amino şekerleri) içeren dallanma­mış uzun zincirli polisakkaritlerdir. Çok sayıda glikozami- noglikan zinciri, düzgün aralıklarla bir protein özdek boyun­ca dizilerek proteoglikanları oluşturur. Bağ dokusu mat-riksinin önde gelen yapılarından bazılarını proteoglikanlar oluşturur (5. ve 7. Bölümlere bakınız). Glikoproteinlerin ak­sine, proteoglikanlardaki karbonhidrat zincirleri molekülün esas bileşenini oluşturur. Glikozaminoglikanlar ve asidik gli­koproteinler karboksil ve sülfat gruplarının çokluğu nede­niyle güçlü anyonik özelliğe sahiptir. Bu nedenle, bunlar al- siyan mavisi boyasıyla kuvvetli tepkime verirler.
Lipitler en iyi şekilde, lipit içinde çözünebilen boyalarla gös­terilirler. Bu yöntemde, dondurulmuş kesitler, uygun boya­larla doyurulmuş alkolik çözeltiler içine daldırılır. Sonra bo­ya, alkolden hücresel lipid damlacıklarına doğru güç eder. Bu amaçla en çok Sudan IV ve Sudan siyahı boyaları kulla­nılır. Boya hücredeki lipit damlacıkları içinde çözülerek kır­mızı ya da siyaha boyar. Kolesterol ve kotesterol esterleri, fosfolipler ve glikolipidlerin belirlenmesi için kullanılan ek yöntemler, farklı tür lipkllerin hücre içine biriktiği metabolik hastalıkların tanısında yararlıdır.


















Laboratuvar tanıda demir için Perls reaksiyonu, glikojen ve glikozaminglikanlar için PAS-amilaz ve alsiyan mavisi tepkimesi gibi pek çok histokimya- sal yöntem sık olarak kullanılır. Lipitlere yönelik tepkimeler rutin olarak dokularda demir (hemok- romatoz, hemosideroz, glikojen (glikojenoz), gli­kozaminglikanlar (mukopolisakkaridoz) ve sfingo- lipidler (sfingolipidoz) birikimine yol açan bir has­talığı bulunan hastalardan alınan doku biyopsile­rinde lipit reaksiyonları rutin olarak kullanılır.



Bir doku kesitinde bulunan özgül bir molekül, o molekül ile özel olarak etkileşen bileşikler kullanılarak saptanabilir. Mo­lekülle etkileşecek olan bileşiklerin ışık ya da elektron mikroskopu ile belirlenebilecek olan bir belirteçle işaretlenmesi gerekir (Şekil 1-20). En sık kullanılan belirteçler floresan bi­leşikler (floresan ya da lazer mikroskopu ile görülebilir), radyoaktif atomlar (otoradyografi ile saptanabilir), peroksi­daz molekülleri (hidrojen peroksit ve 3,3-diaminobenzidin ile enzim gösterildikten sonra saptanabilir) ya da başka en­zimler (ilgili sübstratlarıyla saptanabilir) ve ışık ve elektron mikroskopunda görülebilen metal (genellikle altın) parça­cıklarıdır. Bu yöntemler genellikle şekerleri, proteinleri ve nükleik asitleri saptamada kullanılır.


Diğer moleküllerle özgül olarak etkileşen bileşiklere örnek olarak falloidin, protein A, lektinler ve antikorlar gösterilebilir.
Bir mantardan (Amanita phalloides) elde edilen falloidin, aklinle güçlü bir biçimde etkileşim gösterir ve genellikle mik- rofilamanları göstermek için floresan boyalarla işaretlenir.
Staphylococcus aureus’tan elde edilen bir protein olan protein A immünglobulin molekülünün (antikor) Fc bölge­sine bağlanır. Protein A bir belirteçle işaretlendiğinde im- münglobulinler saptanabilir (bkz. İmmiinohistokimya).
Lektinler, esas olarak bitki tohumlarından türetilen pro­teinler ya da glikoproteinlerdir ve yüksek bir çekim ve öz­güllükle karbonhidratlara bağlanırlar. Farklı lektinler özgül şekerlere ya da şeker kalıntı dizilerine bağlanırlar. Lektinler, glikoproteinlere, proteoglikanlara ve glikolipitlere bağlanır­lar ve özgül şeker kalıntı dizilerini içeren zar moleküllerini betimlemek için yaygın olarak kullanılırlar.

Moleküller arasında yüksek düzeyde özgül etkileşimlerden birisi de antijen ile antikor arasında gerçekleşir. Bu nedenle özgül proteinlerin yerini belirlemede en büyük yararı işaret­li antikorların kullanıldığı yöntemlerin sağladığı kanıtlanmış­tır. Vücutta, kendi (öz) moleküllerini yabancı moleküllerden ayırt edebilen hücreler bulunmaktadır. Vücut, yabancı mole­küllerle—antijenlerle—karşılaştığında, bunlarla özgül ola­rak etkileşen ve antijene bağlanan proteinler—antikorlar— üreterek yabancı maddenin ortamda etkisiz kılınmasına yar­dımcı olur. Antikorlar, immünglobulin olarak adlandırılan büyük bir aileye ait proteinlerdir.
İmmünohistokimyada, belli bir proteini barındırabileceği düşünülen doku kesiti (ya da kültürde çoğaltılmış olan hüc­reler) bu proteinin antikorunu içeren bir çözelti içinde kuluçkalanır (inkübasyon). Antikor, özgül olarak bu proteine bağlandıktan sonra, antikoru işaretlemek üzere kullanılan bileşiğin tipine bağlı olarak, ışık ya da elektron mikroskop ile söz konusu proteinin yeri belirlenebilir.
İmmiinhistokimya için gereken en önemli koşullardan biri­si, belirlenecek olan proteine karşı bir antikomn bulunmasıdır. Yani, proteinin daha önceden saflaştırılarak ayrılması, bu şekil­de antikorların üretilebilmesi gerekir. Şekil 1-21 ve 1-22’de pro­teinlerin ayrılmasına ilişkin bazı yöntemler gösterilmektedir.
POLİKLONAL VE MONOKLONAL ANTİKORLAR
Amacımızın, belli hayvan türlerinin (örneğin sıçan ya da in­san) x proteinine karşı antikorlar üretmek olduğunu varsa­yalım. X proteini daha önce yalıtılmış ise, başka bir türe (ör., tavşan ya da keçi) enjekte edilir. Söz konusu protein bu hay­van için yabancı—yani antijen—olarak algılanacak kadar farklıysa, hayvan, bu proteine karşı antikorlar üretecektir (ör., sıçan x’ine karşı tavşan antikoru ya da insan x’ine kar­şı keçi antikoru). Bu antikorlar, hayvanın plazmasından top­lanır ve immiinohistokimya için kullanılır.
X proteini enjekte edilen hayvanların birkaç lenfosit gru­bu (klonu) x proteininin farklı bölgelerini tanıyabilir ve her bölüme karşı farklı antikor üretebilir. Bu antikorlar poliklo- nal antikorlardan oluşan bir karışım oluştururlar.
Bununla birlikte, x proteinini hücre kültüründe yaşatılan lenfositlere (aslında tümör hücrelerine tutunmuş lenfositler) yönelik olarak elde etmek de olasıdır. Farklı lenfosit klonla- rı x proteininin birkaç bölümüne karşı farklı antikorlar üre­tecektir. Her klon, x proteinine karşı farklı antikorlar ayrı olarak toplanabilecek şekilde birbirinden ayrı olarak yalıtıla- bilir ve kültürde yaratılabilir. Bu antikorların her biri bir mo­noklonal antikordur. Monoklonal antikor kullanımının, poliklonal antikor kullanımına göre bir çok avantajı bulun­maktadır: söz gelimi, belirlenmek istenen proteine karşı yüksek düzeyde özgül ve buna güçlü bir biçimde bağlana­cak monoklonal bir antikor seçilebilir. Bu yüzden, özgül ol­mayan başka proteinlerin, x proteininin saptanmasını güç­leştirebilecek biçimde bağlanması engellenmiş olur.Doğrudan immünohistokimya yönteminde, antiko­run (ister monoklonal, ister poliklonal) uygun bir etiketle işaretlenmesi gerekir. Doku kesitleri, x’e karşı işaretlenmiş antikorla kuluçkalanır, antikor özgül olarak etkileşime girer ve x proteinine bağlanır. Bağlanmayan antikoru uzaklaştır­mak amacıyla kesit yıkanır (Şekil 1-23). Kullanılan işaretleyi-olarak peroksidaz ya da başka bir en­zim kullanılması durumunda doku kesiti mikroskopla ince­lenmeden önce enzimin saptanması gerekir (bkz. Histokim- ya ve Sitokimya). Doku kesitinde x proteinini içeren alanlar belirteç enzimin varlığına bağlı olarak lloresan özellik kaza­nacak ya da üzeri altın parçacıklarıyla veya koyu renk bir çökelti ile kaplanacaktır.
Dolaylı immünohistokimya yöntemi daha duyarlıdır ancak daha fazla basamak içerir. Sıçanlarda bulunan bir x pro­teinini saptamak istediğimizi varsayalım. İmmiinohistokimya- sal reaksiyona yönelmeden önce iki işlemin gerçekleştirilme­si gerekin (1) öncelikle başka bir hayvan türünde (ör., tav­şan), sıçan x proteinine karşı antikorların üretilmesi gerekir; (2) bu işleme koşut olarak, normal (enjeksiyon yapılmamış) bir tavşandan alınan immünglobulinin üçüncü bir hayvan tü­rüne (ör., koyun ya da keçi) enjekte edilmesi gerekir. Tavşan immünglobulinleri koyun ya da keçi tarafından yabancı ola­rak benimsenir ve bu nedenle o hayvanda antikor (anti-anti- kor ya da anti-immiinoglobulin) oluşturma niteliğine sahiptir.
Dolaylı immiinohistokimyasal saptama yönteminde ilk olarak x proteini içerdiğine inanılan sıçan dokusu kesiti tav­şan anti-x antikoru ile kuluçkalanır. Yıkamadan sonra doku kesitleri tavşan antikorlarına karşı işaretlenmiş koyun ya da keçi antikorları ile kuluçkalanır. Anti-antikorlar x proteinini tanımış olan tavşan antikorlarını tanıyacaktır (Şekil 1-24). X proteini, ikincil antikorda kullanılan belirtece uygun mikros­kobik teknik kullanılarak saptanabilir. Avidin-biyotin tekniği gibi diğer ara moleküllerin kullanıldığı başka dolaylı yön­temler de bulunmaktadır.




Şekil 1-21. Protein yalıtma yöntemleri olan ultrasantrifüj (A) ve kromatog- rafi (B). A: Homojenize edilen hücrelerden ya da dokulardan elde edilen protein karışımı birkaç saat boyunca yüsek hızda çevrilir. Proteinler mole­küllerin büyüklüğüne ve yoğunluğuna bağlı olarak birkaç banda ayrılır. Ult­rasantrifüj medyumu süzülerek daha sonra analiz edilebilecek biçimde farklı proteinleri içeren birkaç fraksiyon halinde toplanır. B: Homojenize edilen hücrelerden ya da dokulardan elde edilen protein karışımını içeren çözelti, farklı kimyasal özelliklere sahip parçacıklarla dolu olan bir kolon içine konur. Sözgelimi bu parçacıklar farklı elektrostatik yüklere (proteinle­ri yüklerine göre çeken) ya da farklı boyda gözeneklere (farklı boy mole­külleri geçiren elek işlevi gören) sahip olabilir. Proteinlerin sütundan geçi­şi sırasında parçacıklarla etkileşimlerine göre hareketleri yavaşlar. Akış ta­mamlandığında, farklı protein grupları ayrı olarak toplanabilir.



İmmünositokimya, hücre biyolojisindeki araştır­malara ve tıbbi tanı yöntemlerinin geliştirilmesine somut olarak katkıda bulunmaktadır Şekil 1- 25'ten 1-28’e dek molekülleri immünohistokimya- sal olarak saptama yöntemlerine ilişkin örnekler gösterilmektedir. Tablo 1-1'de klinik uygulamada kullanılan immünositokimyasal yöntemlerin bazı alışılmış uygulamaları gösterilmektedir






Modern hücre biyolojisinde uğraşılan temel işi, moleküler düzeyde hücrelerin işlevlerini anlamak oluşturmaktadır. Bu amaca ulaşmak için, DNA’dan proteine bilgi akışı işlemine katılan moleküllerin analizine olanak tanıyan tekniklere ge­reksinim vardır. Bu tekniklerin çoğu hibridizasyona dayan­maktadır. I-Iibridizasyon, tamamlayıcı olması durumunda birbirini tanıyan iki niikleik asit dizisini (DNA ile DNA, RNA ile RNA ya ckı RNA ile DNA) arasında bağlantı oluşturulma­sıdır. Niikleik asit dizilimleri arasındaki benzerlik ne denli fazlaysa, tamamlayıcı dizilerden çift sıralı “hibrid” molekül­lerin oluşması o denli kolaydır. Bu durumda hibridizasyon- la, özgül DNA ve RNA dizilerini saptamak olasıdır.
İN SiTU HİBRİDIZASYON
Söz konusu teknik hücrelere ve doku kesitlerine, yaymalara ya da mitozda dağılmış kromozomlara doğrudan uygulandı­ğında, in situ hibridizasyon adını alır. Bu teknik hücrede özgül bir DNA dizisi (bir gen ya da genin bir bölümü) bulun­ması durumunda, özgül bir genin okunduğu hücrelerin han­gileri olduğunu belirlemek ya da özgül bir kromozomda bu­lunan bir genin yerini saptamak için idealdir. İlk olarak hüc­re içindeki DNA’nın ısı ya da doğasını bozucu maddeler kul­lanılarak denatüre edilip, iki DNA iplikçiğinin birbirinden ayrılması gerekir. Daha sonra bu iplikçikler, tek iplik üzerin­de belirlenmek istenen dizinin karşılığını taşıyan DNA ya da RNA parçacığı ile “hibridleştirilmeye" hazır hale gelir. Bu di­ziye prob adı verilir. Prob, klonlanarak, hedef diziyi PCR ile çoğaltarak ya da istenen dizi kısaysa sentezleyerek elde edi­lebilir. Probun, genellikle radyoaktif bir izotop (otoradyog- rafi ile saptanabilir) ya da immünohiztokimya ile belirlene­bilen değiştirilmiş bir nuikleotid (digoksigenin) gibi bir işa­retleyici ile işaretlenmesi gerekir.hücreler, yaymalar ya da mitoz sırasında patlatılmış olan hücrelerin kromozomlarının ısıtılarak çift sıralı DNA’larının ayrılması gerekir. Daha sonra örneğin üzerine hibridizasyon için gereken süre boyunca probu içeren çözelti konur. Pro­bun fazlası yıkandıktan sonra, taşıdığı işaret aracılığıyla tu­tunmuş olan probun yeri belirlenir (Şekil 1-29).

Şekil 1-22. Jel elektroforezi: Protein ayırma yöntemidir. A: Proteinlerin ayrılması. (1) Homojenize edilen hücrelerden ya da dokulardan protein karışımları elde edilir. Protein alt birimlerini açmak ve birbirinden ayırmak için genellikle güç­lü bir deterjan (sodyum dodesil sülfat) ve merkaptoetanol ile işlem yapılır. (2) Örnekler elektriksel alan oluşturulan poliakrilamid jel havuzlarına konur. Proteinler boyutlarına ve şekillerine göre jel içinde hareket eder. (3) Jel üzerine, diğer proteinlerin molekül kütlesini belirlemek üzere olarak molekül ağırlığı bilinen (referans) proteinlerden oluşan bir karışım eklenir. B: Proteinlerin saptanması ve belirlenme­si. (1) Boyama. Tüm proteinler aynı renk boyanır. Renk yo­ğunluğu protein derişimi ile doğru orantılıdır. (2) Otorad- yografi. Radyoaktif proteinler otoradyografi ile saptanabilir. Jel üzerine belli bir süreyle röntgen filmi konur ve sonra bu film banyo edilir. Radyoaktif proteinler film üzerinde koyu renk bandlar biçiminde görünecektir. (3) İmmün işaretle­me. Proteinler jelden, nitroselüloz bir zar üzerine aktarıla­bilir. Bu zar, örnekte bulunabilecek antijenlere karşı oluştu­rulan antikor ile inkübe edilir.







Hibridizasyon, katı ortamlarda saflaştırılmış DNA ya da RNA ile de gerçekleştirilebilir. Niikleik asit karışımları agar jeli ya da poliakrilamid jeli içinde elektrolorezle ayrılır. Poli- akrilamid jeli daha yüksek düzeyde çözümlemeye olanak ta­nır. Elektroforezden sonra, farklı boylardaki nükleilc asit mo­lekülleri naylon ya da nitroselüloz yaprağına aktarılır: kapi- ler etkiyle, jel ile zar arasından naylon ya da nitroselüloz yaprağına yeğin bir biçimde tutunacak olan nükleik asit mo­leküllerini taşıyan bir tampon geçirilir. Nükleik asitler buyapraklar üzerinde ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Bu DNA saptama tekniğine Southern belirtimi adı verilir. RNA elektroforezi gerçekleştirildiğinde, teknik Northern belirtimi adı­nı alır.
Hibridizasyon teknikleri yüksek düzeyde duyarlıdır ve araştırma, klinik tanı ve adli tıp alanında rutin olarak kulla­nılmaktadır.


İn situ hibridizasyonda, doku kesiti, kültürde çoğaltılan yapraklar üzerinde ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Bu DNA saptama tekniğine Southern belirtimi adı verilir. RNA elektroforezi gerçekleştirildiğinde, teknik Northern belirtimi adı­nı alır.
Hibridizasyon teknikleri yüksek düzeyde duyarlıdır ve araştırma, klinik tanı ve adli tıp alanında rutin olarak kulla­nılmaktadır.

DOKU KESİTLERİNİN YORUMLANMASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR
Mikroskop preparatlarında, boyanmış doku kesitlerinin çalı­şılması ve yorumlanması sırasında incelenen örneğin, esas olarak tespit ile başlayıp, boyama ile sona eren bir dizi iş­lemden sonra elde edilen en son ürün olduğu unutulmama­lıdır. Doku takibi işleminin bir çok basamağı dokuların gö­rünümünü bozarak canlı lıaldekinden daha farklı görünüm oluşmasına neden olabilir. Bu bozulmaya yol açan nedenler­den biri tespit edici, etanol ve parafine gömme için gereken ısıtma işlemine bağlı büzülmedir. Doku örnekleri reçineye gömüldüğünde bu olumsuzluklar azaltılabilir.
Bu uygulamaların bir sonucu olarak çoğu kez yapay ola­rak hücreler ve diğer doku bileşenleri arasında boşluklar or­taya çıkar. Yapay boşluklarını oluşturan başka bir neden de tespit maddesinin doku İçinde düzgün biçimde tespit ede­mediği moleküllerin kaybolması ya da su alıcı ve saydamlaş­tırıcı sıvılar tarafından bulunduğu yerden uzaklaştırılmasıdır.
Kesitlerin doku takibi işlemleri sırasında yapay olarak or­taya çıkan tüm bu boşluklara ve diğer bozuk görüntülere artefakt (kusur) denir. Başka kusurlar arasında kesitin katlan­ması (kılcal kan damarı ile karıştırılabilir), boya çökeltileri (sitoplazmik graniillerle karıştırılabilir) ve başkaları sayılabi­lir. Öğrencilerin, kesitlerde kusur olabileceğini bilmeleri ve bunları yanılmaksızın tanımaları gerekir























Histolojik kesitlerin çalışılması sırasında karşılaşılan başka bir güçlük de tüm doku bileşenlerinin sadece tek bir lam üzerinde farklı olarak boyanmasının mümkün olmamasıdır. Işık mikroskopta incelenen hücrelerin çekirdeklerini, mito- kondrilerini, Iizozomlarını ve peroksizomlarını, hücreleri çevreleyen bazal membranın yanı sıra kolajen, elastik ve re- tiküler lifleri görmek neredeyse olanaksızdır. Herhangi bir dokunun tüm bileşimi ve yapısı hakkında genel bir fikir el­de edinmeden önce, her biri farklı yöntemle boyanmış bir­kaç preparatın incelenmesi gerekmektedir. Öte yandan, transmisyon elektron mikroskobu hücreyi tüm organelleriy- le, inklüzyonlarıyla ve çevresindeki hücre dışı matriks bile­şenleriyle gözlemleyebilmemizi sağlar.
Üç boyutlu bir yapı çok ince kesildiğinde, kesitler en ve boy olarak yalnızca iki boyuta sahip gibi gözlenir. Bu durum, ke­site bakan kişinin dokuda küre şeklindeki bir yapının kesit­te daire, tüp yapısının ise halka şeklinde göründüğünü an­lamaması durumunda yanıltıcı olur (Şekil 1-30). Mikroskop­ta bir kesit incelenirken, pek çok yapı kesitten daha kalın ol­duğundan, kesitin arkasında ya da önünde bir şeylerin göz­den kaçabileceği düşünülmelidir. Aynı zamanda, bir doku­nun içindeki yapıların gelişigüzel kesildiğini de unutmamak gerekir.
























































Alberts B et al: Molecular Biology of the Cell, 3rd ed. Garland, 1994.

Bancroft JD, Stevens A: Theory and Practice of Histological Techniques, 2nd ed.

Churchill Livingstone, 1990.

Cuello ACC: Immunocytochemistry. Wiley, 1983.

Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular Cell Biology, 2nd ed. Scientific American Books, 1990.

Hayat MA: Stains and Cytochemical Methods. Plenum, 1993.
James J: Light Microscopic Techniques in Biology and Medicine. Martinus Nijhoff, 1976.

Junqueira LCU et al: Differential staining of collagen types I, II and III by Sirius Red and polarization 

microscopy. Arch Histol Jpn 1978;41:267.


Meek GA: Practical Electron Microscopy fir Biologists. Wiley, 1976.

Pease AGE: Histochemistry: Theoretical and Applied, 4 th ed. Churchill Living­stone, 1980.

Rochow TG, Tucker PA: Introduction to Microscopy by Means of Light, Elec­trons, X Rays, or 

Acoustics. Plenum Press, 1994.

Rogers AW: Techniques of Autoradiography, 3rd ed. Elsevier, 1979.


Rubbi CP: Light Microscopy. Essential Data
. Wiley, 1994.
Spencer M: Fundamentals of Light Microscopy. Cambridge Univ Press, 1982. Stoward PJ, Poiak JM (editors): Histochemistry: The Widening Horizons of Its Applications in Biological Sciences. Wiley, 1981.

Yorumlar